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美鳳力臨床前大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心
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肺癌是全球癌癥死亡的首要原因，其中肺腺癌是肺癌最常見(jiàn)的類(lèi)型之一。肺腺癌具有復(fù)雜的病理亞型分類(lèi)，不同階段不同亞型的肺腺癌有著不同的預(yù)后。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌的發(fā)病率相對(duì)較高，且具有多發(fā)性等特點(diǎn)，這對(duì)肺腺癌的診斷和治療有較大的挑戰(zhàn)性。因此，為了進(jìn)一步探究肺腺癌的進(jìn)展過(guò)程，我們需要一個(gè)更加貼合人類(lèi)肺腺癌進(jìn)展過(guò)程的臨床前模型來(lái)深入探討肺腺癌的發(fā)生機(jī)制。
目前腫瘤臨床前模型方法主要包括化學(xué)誘導(dǎo)、移植和基因編輯三大類(lèi)別。其中基因編輯模型具有效率高，生存期長(zhǎng)，在研究腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及腫瘤微環(huán)境等方面發(fā)揮重要作用。通過(guò)CRISPR/Cas9等基因編輯工具，我們可以移除或植入某些特定的基因，從而激活動(dòng)物形成腫瘤的模式。大鼠肉瘤（rat sarcoma，RAS）致癌基因是人類(lèi)癌癥中最常突變的癌基因，Kirsten大鼠肉瘤（KRAS）是最常見(jiàn)的突變RAS亞型。人類(lèi)肺癌31%～35%發(fā)現(xiàn)了KRAS癌基因的激活突變。KRAS突變?cè)诜蜗侔┲懈Ｒ?jiàn)（20%～40%），在鱗狀NSCLC中較少見(jiàn)（約5%）。KRAS是一種與細(xì)胞膜相關(guān)的鳥(niǎo)苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）信號(hào)蛋白，它調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和存活過(guò)程。超過(guò)80%的致癌 KRAS 突變發(fā)生在密碼子12,其中甘氨酸殘基被不同的氨基酸取代，導(dǎo)致 KRAS 突變腫瘤的基因組異質(zhì)性。在肺癌中，KRAS 癌基因替換通常發(fā)生在外顯子2的密碼子12和13處，常見(jiàn)的密碼子變體包含 G12C、G12D、G12V和G12A。
國(guó)際上應(yīng)用最廣泛的肺癌動(dòng)物模型就是KRASLSL-G12D小鼠模型，通過(guò)與肺上皮細(xì)胞特異性的環(huán)化重組酶（Cyclization Recombination Enzyme，Cre）轉(zhuǎn)基因小鼠雜交或用慢病毒或腺病毒遞送Cre至肺組織內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)KRAS突變體的激活，從而導(dǎo)致肺癌的發(fā)生。KRASLSL-G12D中致癌KRAS突變的表達(dá)由一個(gè)可移動(dòng)的轉(zhuǎn)錄終止元件Lox-Stop-Lox控制。在去除終止元件后，內(nèi)源性水平的致癌KRASG12D被表達(dá)。去除終止元件是通過(guò)Cre來(lái)實(shí)現(xiàn)，Cre是一種重組酶，來(lái)源于P1噬菌體，其基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029 bp, 為38 kDa大小的、由343個(gè)氨基酸組成的多肽單體蛋白。Cre能識(shí)別特異的DNA序列，即loxP位點(diǎn)，使兩個(gè)loxP位點(diǎn)間發(fā)生基因重組。本實(shí)驗(yàn)利用氣管插管遞送載有Cre重組酶的腺病毒（adenoviruses expressing Cre，Ad-Cre）感染KRASLSL-G12D條件突變小鼠肺組織細(xì)胞，通過(guò)切除位于KRASG12D轉(zhuǎn)基因上游的Lox-Stop-Lox, 進(jìn)而使肺組織表達(dá)KRAS突變。
由于B6-KRASLSL-G12D純合子胚胎期即發(fā)生死亡，因此使用的KRAS條件突變小鼠均為雜合子，在繁衍過(guò)程需要不斷進(jìn)行基因鑒定，出生后1～2周的小鼠收集少量腳趾或鼠尾組織，使用小鼠組織直接PCR試劑盒進(jìn)行基因PCR鑒定，根據(jù)說(shuō)明書(shū)配置PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：(1) 預(yù)變性94 ℃,5 min; (2) 35個(gè)循環(huán)反應(yīng)：變性94 ℃,10 sec ;退火60 ℃,20 sec; 延伸72 ℃,30 sec; (3) 終延伸72 ℃,5 min。反應(yīng)結(jié)束后各取4 μL,進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳（100 V, 30 min），電泳完畢進(jìn)行核酸凝膠顯像。
在1～8個(gè)月每個(gè)時(shí)間段均成功造模20只小鼠，其中雌鼠和雄鼠各10只。通過(guò)小鼠肺HE染色，統(tǒng)計(jì)肺腺癌成瘤情況。結(jié)果顯示1個(gè)月的成瘤率為20%，2個(gè)月30%，3個(gè)月50%，4個(gè)月70%，5個(gè)月90%，6～8個(gè)月均為100%。通過(guò)各個(gè)感染時(shí)間的成瘤率繪制折線(xiàn)圖，可以看出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，成瘤率越來(lái)越高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到6個(gè)月時(shí)，所有的小鼠均發(fā)生了肺腺癌。
通過(guò)構(gòu)建肺腺癌模型，我們可以更好地模擬人類(lèi)肺腺癌的發(fā)展過(guò)程，從而提高對(duì)肺腺癌病理學(xué)和分子生物學(xué)的理解。相較于化學(xué)誘導(dǎo)模型或移植瘤模型，基因編輯模型更貼近生物學(xué)真實(shí)情況，更準(zhǔn)確地反映了腫瘤的自然發(fā)展過(guò)程。我們的模型允許控制腫瘤發(fā)生的時(shí)間，且成瘤周期與自發(fā)性腫瘤類(lèi)似?？捎糜谟^察不同階段的肺腺癌情況，為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供重要的研究工具。既往對(duì)小鼠肺腺癌原位移植瘤的研究顯示，原位移植瘤的成瘤時(shí)間基本在1個(gè)月內(nèi)。相對(duì)于原位移植瘤，基因編輯模型的成瘤時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，生存期也相對(duì)較長(zhǎng)，這為藥物研發(fā)提供了更長(zhǎng)的觀察期，為新藥的研發(fā)提供了更為充分的時(shí)間窗口。
Source: 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué). 2024, 32 (18)，KRAS條件突變小鼠肺腺癌模型的構(gòu)建
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