特發(fā)性炎性肌?。↖diopathic Inflammatory Myopathy，IIM）是一種病因不明的、以四肢近端肌肉受累和慢性炎癥為突出表現(xiàn)的異質(zhì)性疾病，肌肉無力是其最典型的臨床表現(xiàn)。根據(jù)目前已知的不同IIM特異性自身抗體、臨床組織病理學(xué)和血清學(xué)特征，IIM可以分為皮肌炎（Dermatomyositis，DM）、抗合成酶綜合征（Antisynthetase Syndrome，ASS）、免疫介導(dǎo)壞死性肌?。↖mmune-mediated Necrotizing Myopathy，IMNM）、包涵體肌炎（Inclusion Body Myositis，IBM）和多發(fā)性肌炎（Polymyositis，PM）。隨著疾病的發(fā)展，不同程度的肌炎會使皮膚、肺、關(guān)節(jié)和心臟等多個系統(tǒng)及器官受累。間質(zhì)性肺?。↖nterstitial Lung Disease，ILD）是IIM肺受累的最常見臨床表現(xiàn)?？购铣擅缚贵w（Anti-Synthetase Antibody，ASA）和肌炎特異性自身抗體（Myositis Specific Autoantibody，MSA）與IIM患者中ILD的發(fā)生密切相關(guān)。目前有較多針對IIM動物模型的研究，但I(xiàn)IM-ILD相關(guān)的動物模型卻鮮有報道?？偨Y(jié)IIM和IIM-ILD相關(guān)的動物模型，旨在通過這些模型提高研究者對該疾病發(fā)病機(jī)制的理解和認(rèn)識，并為未來開發(fā)具有針對性的治療方案提供參考。
IIM相關(guān)的動物模型：
實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎模型
通過將同種肌肉勻漿混合完全弗氏佐劑（CFA），在豚鼠背部皮下多次免疫，建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎（Experimental Autoimmune Myositis，EAM）動物模型。在SJL/J小鼠中通過勻漿或部分純化的肌球蛋白混合CFA誘導(dǎo)產(chǎn)生肌炎，SJL/J小鼠有dysferlin基因突變，可導(dǎo)致自發(fā)性肌肉壞死和繼發(fā)性肌肉炎癥，肌肉中浸潤的T細(xì)胞以CD4+T細(xì)胞為主。通過大鼠肌球蛋白和百日咳毒素（PT）兩次免疫接種，誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的自身免疫性肌炎，證實(shí)C蛋白是肌球蛋白中的主要免疫原。通過給B6小鼠單次皮下注射小鼠或人類的C蛋白片段混合CFA，同時腹腔內(nèi)注射百日咳毒素，構(gòu)建了C57BL/6（B6）小鼠EAM模型。
在前期EAM模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行改良，提高了大鼠骨骼肌上清液的質(zhì)量濃度（30 g/L）和百日咳毒素的量（2 ng/只），增大每次注射骨骼肌上清液與CFA劑量（0.5 m L/只），誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生了更嚴(yán)重的肌炎和肺部病變。使用部分純化的豚鼠骨骼肌肌球蛋白誘導(dǎo)BALB/c產(chǎn)生EAM，90 d后剖殺取材。通過檢測血清自身抗體濃度，發(fā)現(xiàn)Ro-52、OJ、EJ、PL-12、PL-7、SRP、Jo-1、PM-Scl75和Ku抗體在模型組動物中高表達(dá)，而Scl100和Mi-2β抗體并未表達(dá)；肌纖維存在大量炎性細(xì)胞浸潤，小鼠肌肉力量測試顯示，第14天下降了50%，第90天下降了45%，提示小鼠出現(xiàn)了抗合成酶綜合征；與此同時，此模型發(fā)生ILD的比例較高，可模擬ASS臨床患者高發(fā)病率特征。
EAM的造模原理目前并未完全闡明，一般認(rèn)為骨骼肌中C蛋白是小鼠產(chǎn)生免疫的主要肌源性抗原，可誘發(fā)強(qiáng)烈的自身免疫反應(yīng)。此模型也被認(rèn)為與人類PM相似，主要表現(xiàn)為肌肉組織炎性浸潤和肌纖維萎縮，同時近膜和血管周圍區(qū)域CD4+T細(xì)胞浸潤增加，是最早也是應(yīng)用最廣泛的肌炎模型。部分EAM小鼠存在肺部損傷和病變，可部分模擬PM-ILD的臨床表現(xiàn)，但存在造模周期較長、無統(tǒng)一造模方法、ILD發(fā)病率不穩(wěn)定等問題。
感染鼠模型
部分感染柯薩奇病毒B1（coxsackievirus B1，CVB1）的患者會出現(xiàn)骨骼肌病變，產(chǎn)生肌炎。CVB1是Picornaviridae家族（Enterovirus屬）的成員之一，是一種單股正鏈RNA病毒?？滤_奇病毒的致病機(jī)制取決于特定的病毒-受體相互作用?？滤_奇病毒腺病毒受體（CAR）和衰變加速因子（DAF）相互作用有助于CVB進(jìn)入肌細(xì)胞，最終導(dǎo)致組織損傷。
接種CVB1的小鼠會發(fā)展成劑量依賴性、快速進(jìn)展的近端后肢肌炎，死亡率高達(dá)30%。同時，接種羅斯河病毒（RRV）或基孔肯雅病毒（CHIKV）以及原生動物寄生蟲也會導(dǎo)致動物肌肉損傷。此動物模型特點(diǎn)主要表現(xiàn)為小鼠體質(zhì)量減輕、活動減少和力量下降，同時血清肌酶水平增加，有肌纖維壞死、炎性細(xì)胞內(nèi)膜浸潤等病理表現(xiàn)，目前主要用于模擬由病毒感染導(dǎo)致肌炎患者的臨床表現(xiàn)。此模型也可部分模擬臨床PM患者的肺部改變，但存在死亡率過高、模型構(gòu)建需要病毒實(shí)驗(yàn)操作條件等局限性。
含纈酪肽蛋白（Valosin-containing Protein，VCP）相關(guān)的IBM模型
在129/Sv Ev小鼠體內(nèi)插入VCP突變R155H基因片段，得到了VCPR155H/+小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠肌肉VCPR啟動子調(diào)節(jié)下，R155H突變的轉(zhuǎn)基因過度表達(dá)，肌肉病理學(xué)顯示肌纖維大小改變、內(nèi)膜結(jié)締組織增加、線性嗜堿性邊緣裂紋以及肌漿和肌核液泡泛素顯示陽性；含甾蛋白（VCP）功能變異，導(dǎo)致致病性增加，其特征類似于人類IBM；雜合子小鼠在12個月左右出現(xiàn)進(jìn)行性肌無力，細(xì)胞質(zhì)TDP-43易位，15個月時泛素水平升高，泛素可以增強(qiáng)骨骼肌的自噬，加重骨骼肌的損傷；HE染色分析發(fā)現(xiàn)肌纖維空泡化，線粒體異常腫脹，同時肌纖維間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。此模型主要用于研究泛素或VCP相關(guān)基因?qū)⊙椎挠绊懀珶oILD相關(guān)報道。
主要組織相容性復(fù)合物（Major Histocompatibility Complex，MHC）高表達(dá)肌炎小鼠模型
使用MHC轉(zhuǎn)基因肌炎小鼠模型，利用5周齡小鼠飲用加入多西環(huán)素的水來誘導(dǎo)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模型，在其9～13周齡進(jìn)行剖殺，對小鼠肌肉組織進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，患有肌炎的小鼠顯示出較為嚴(yán)重的內(nèi)臟炎癥和肌纖維炎癥浸潤，肌炎小鼠肌肉組織中Toll樣受體-7、Ⅰ型干擾素（IFN）和核因子（NF）-κB基因表達(dá)較野生型小鼠增加約80倍。此模型與臨床部分患者高Ⅰ型IFN和NF-κB表達(dá)相似，但無肺部損傷相關(guān)報道。
基因敲除導(dǎo)致的肌炎模型
缺乏突觸結(jié)合蛋白Ⅶ（SytⅦ）小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞不易受到錐體蟲的侵襲，SytⅦ相關(guān)基因突變的小鼠皮膚和骨骼肌存在廣泛纖維化；研究者隨后構(gòu)建了SytⅦ-/-基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠各器官和肌肉存在廣泛的炎癥和纖維化灶，巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤明顯，同時伴隨有白細(xì)胞浸潤、骨骼肌廣泛纖維化、內(nèi)膜膠原蛋白沉積、肌酸激酶升高和進(jìn)行性肌無力。SytⅦ-/-基因敲除小鼠的病理表現(xiàn)與人類PM/DM非常相似，病變部位也主要發(fā)生在機(jī)械應(yīng)激的組織、皮膚和骨骼肌中，在患者中也觀察到了類似的情況。這表明機(jī)械損傷是組織自身免疫性疾病病因?qū)W的一個重要因素，但并無SytⅦ-/-小鼠ILD相關(guān)報道。
MSA誘導(dǎo)的肌炎模型
轉(zhuǎn)錄中間因子1（TIF1）γ誘導(dǎo)的肌炎（TIF1γ-induced Myositis，TIM）模型
TIF1γ是一種在DM患者中檢測到的MSA。對B6小鼠每周皮下注射重組人TIF1γ蛋白與CFA乳化的免疫劑，連續(xù)注射4次，同時腹腔注射百日咳毒素加強(qiáng)免疫建立了TIM模型，免疫組化檢測顯示肌肉纖維中MHCⅠ類和Ⅰ型IFN反應(yīng)分子Mx1的表達(dá)上調(diào)，同時出現(xiàn)大量CD8+T細(xì)胞浸潤和黏附，肌纖維出現(xiàn)萎縮和壞死。但此模型尚無ILD相關(guān)報道。
Jo-1誘導(dǎo)的ASS模型
抗Jo-1抗體陽性的IIM患者ILD發(fā)生率較高。人類組氨酰-t RNA合成酶（HRS/Jo-1）的氨基末端部分含有免疫顯性B和T細(xì)胞表位。用Jo-1和麥芽糖結(jié)合蛋白（Maltose-binding Protein，MBP）生成重組融合蛋白，包括用小鼠Jo-1和人類Jo-1基因產(chǎn)生的結(jié)合蛋白（分別為MA/MBP和HA/MBP），用于隨后的免疫試驗(yàn)；用人或鼠HRS蛋白免疫B6.G7（NOD I-Ag7MHCⅡ類位點(diǎn)交叉到C57BL/6背景）和NOD.Idd3/5（C57BL/6胰島素依賴型糖尿病Idd3/5非MHC位點(diǎn)轉(zhuǎn)入到NOD背景）小鼠，評估HRS定向的B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)在抗合成酶綜合征中的作用及小鼠的肺部損傷情況；用HA/MBP或MA/MBP與CFA乳化，之后免疫B6.G7小鼠，8周后剖殺，經(jīng)HE染色股四頭肌切片發(fā)現(xiàn)，相比于單純CFA免疫，HA/MBP或MA/MBP免疫的小鼠更易出現(xiàn)內(nèi)臟炎癥和肌肉纖維侵襲或退化。m HRS可溶性衍生物可刺激產(chǎn)生肌肉免疫，這種自身抗原可以觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，證明了這些免疫反應(yīng)可以繞過BCR和TCR信號，在新的IIM模型中產(chǎn)生嚴(yán)重的肌肉炎癥。該模型在多個小鼠菌株中具有高度可重復(fù)性，證明這種抗原具有內(nèi)在的免疫刺激特性，此模型也為更好地了解IIM的發(fā)病機(jī)制提供了可能。
IIM相關(guān)ILD動物模型：
目前單純ILD動物模型構(gòu)建主要是以博來霉素（BLM）、二氧化硅、輻射等理化物質(zhì)誘導(dǎo)肺纖維化形成，其中BLM使用最廣泛。BLM是一種水溶性糖肽抗生素，因其可導(dǎo)致肺纖維化而用于實(shí)驗(yàn)性肺纖維化的誘導(dǎo)劑。氣管滴注BLM是標(biāo)準(zhǔn)給藥途徑，會造成中央支氣管周圍纖維化，細(xì)胞外基質(zhì)膠原過度沉積、肺泡塌陷，肺泡和支氣管壁增厚等，與IPF患者表現(xiàn)相似。背部皮下注射BLM可模擬SSc-ILD。BLM誘導(dǎo)的IPF具有復(fù)制性高、時間短、癥狀明顯等優(yōu)點(diǎn)，但在嚙齒類動物模型中，肺纖維化可能會在28 d后自發(fā)退化。且BLM誘導(dǎo)的IPF是化學(xué)損傷后的肺纖維化，這與由肌炎引起的ILD并不相同。因此，構(gòu)建肌炎引起的ILD模型尤為重要。在目前所有報道的肌炎模型中，EAM肌炎模型、感染鼠模型、人Jo-1誘導(dǎo)鼠模型和人MDA5轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)的肺損傷模型中有ILD相關(guān)病理改變，下文將進(jìn)行詳細(xì)論述。
肌肉勻漿誘導(dǎo)的EAM-ILD模型
肌肉勻漿誘導(dǎo)的改良EAM模型中，第5周剖殺發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠出現(xiàn)肺損傷，肺組織病理可見小鼠肺泡炎細(xì)胞浸潤，肺泡間隔水腫、變寬，以及明顯的肺泡塌陷；肺組織內(nèi)可見成纖維細(xì)胞過度增殖和髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）高表達(dá)（MPO是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志物）；在此研究基礎(chǔ)上，研究人員在第21、28天腹腔注射中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）癥狀，典型的病理過程包括早期肺泡上皮細(xì)胞損傷和肺泡中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集引起的明顯炎癥反應(yīng)；之后，成纖維細(xì)胞的增殖明顯，大量膠原沉積，導(dǎo)致蜂窩肺的形成。此模型在一定程度上模擬了臨床患者肺成纖維細(xì)胞的過度增殖與中性粒細(xì)胞的浸潤，中性粒細(xì)胞形成的中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）會損害內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，從而損害肺功能并加速慢性阻塞性肺疾病的進(jìn)展。該研究提示中性粒細(xì)胞在IIM患者的ILD發(fā)展中可能起到重要的作用。此模型與PM患者具有一定的相似性，同時具有操作簡易、癥狀明顯等優(yōu)點(diǎn)。
肌球蛋白誘導(dǎo)的EAM-ILD模型
使用部分純化的豚鼠骨骼肌肌球蛋白誘導(dǎo)EAM，在初次免疫90 d后剖殺小鼠，發(fā)現(xiàn)肌球蛋白可以使小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的肌炎反應(yīng)，同時出現(xiàn)肺部損傷；通過HE和Masson三色染色發(fā)現(xiàn)，支氣管周圍出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，存在過量膠原沉積，出現(xiàn)纖維化病灶；檢測支氣管肺泡灌洗液發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、C反應(yīng)蛋白（CRP）和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1的蛋白表達(dá)水平與健康小鼠相比顯著升高。其他研究也證明這些細(xì)胞因子在ILD背景下通常會有顯著提高。分析肺部的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)TGF-β1介導(dǎo)的纖維化信號通路處于激活狀態(tài)。TGF-β1被認(rèn)為是這一現(xiàn)象中驅(qū)動肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主開關(guān)。此模型提示IIM-ILD可能與TGF-β1介導(dǎo)的纖維化信號通路過度激活相關(guān)。同時首次發(fā)現(xiàn)肌球蛋白誘導(dǎo)的小鼠肌炎模型出現(xiàn)了ASS相關(guān)抗體，可部分模擬ASS患者出現(xiàn)的抗合成酶抗體，但造模時間較長（90 d），且無法得知ILD的具體發(fā)病時間和持續(xù)時間，使藥物篩選和治療存在不可控因素。
CVB1病毒誘導(dǎo)的多發(fā)性肌炎豚鼠模型及其肺間質(zhì)改變
向雌性短毛豚鼠腹腔內(nèi)注射0.5 m L的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）效價為1×10-3的CVB1病毒，連續(xù)3周背部皮下注射CFA與完全乳化的兔肌均質(zhì)物進(jìn)行免疫，于初次免疫4周后剖殺，發(fā)現(xiàn)小鼠存在肺部損傷，但I(xiàn)LD具體發(fā)病時間和持續(xù)時間未知；組織學(xué)研究表明豚鼠肺部組織中出現(xiàn)CD68+T、CD8+T細(xì)胞大量浸潤；肺組織蛋白表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)免疫小鼠組織蛋白酶B（Cathepsin B，CB）、腫瘤壞死因子（TNF）-α和TGF-β1蛋白表達(dá)量顯著增加；同時豚鼠肺部出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤、肺泡間隔擴(kuò)大和肺間質(zhì)纖維化。先前的研究表明，人類半胱氨酸蛋白酶與肺損傷有關(guān)，是肺炎的重要參與者，其中CB可以通過調(diào)控先天免疫的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。抑制CB的過量表達(dá)可以緩解CVB1病毒誘導(dǎo)的多發(fā)性肌炎豚鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡，防止上皮細(xì)胞丟失。此模型也是首次表明CB活性與PM/DM-ILD的纖維化有關(guān)，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。感染鼠模型可以在一定程度上模擬因?yàn)楦腥静《舅鶎?dǎo)致的肌炎，特別是此模型與PM-ILD患者肺部癥狀相似度高。此模型有較強(qiáng)的臨床相關(guān)性。
肌炎自身抗體誘導(dǎo)的ASS-ILD模型
Jo-1誘導(dǎo)的ASS-ILD模型
采用HA/MBP或MA/MBP免疫B6.G7小鼠，8周后剖殺，檢查肺組織病理和肌肉病理切片并HE染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用MA/MBP免疫的B6.G7小鼠有70%表現(xiàn)出肺部炎性細(xì)胞灶，或在肺部氣管、肺動脈分支和血管周圍出現(xiàn)更嚴(yán)重的炎性細(xì)胞密集浸潤；但用HA/MBP免疫的B6.G7小鼠肺部炎性細(xì)胞灶較少，發(fā)病率較低（約45%）。接種MA/MBP的NOD.Idd3/5小鼠也會出現(xiàn)肌肉和肺部炎癥，但與B6.G7小鼠不同，NOD.Idd3/5小鼠需要通過注射OX86（一種純化的大鼠Ig G1，OX40激動劑）進(jìn)行額外的共刺激才能夠引發(fā)明顯的肌肉或肺部病理改變。OX40共刺激可以消除Jo-1免疫時的相對物種特異性，并使接種HA/MBP的NOD.Idd3/5小鼠對小鼠Jo-1抗體的交叉識別更大。這種對共刺激的依賴反映了OX40信號對抗原特異性效應(yīng)器/記憶T細(xì)胞功能和存活率的增強(qiáng)作用。
該模型使用已知的自身抗原來誘導(dǎo)疾病，復(fù)制了人類ASS的特征，可模擬全身肌病及其并發(fā)癥的發(fā)展，特別是70%的免疫小鼠出現(xiàn)了類似于抗Jo-1抗體陽性ILD患者的特征。因此，該模型的完善對于研究IIM-ILD的病理過程至關(guān)重要。
人MDA5轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)的肺損傷
在臨床中，抗MDA5抗體陽性的DM患者的ILD發(fā)病率達(dá)到90%以上。利用人抗MDA5抗體和人類MDA5轉(zhuǎn)基因小鼠模擬臨床抗MDA5抗體患者所出現(xiàn)的肺組織損傷，建立了一個新的自身抗體誘導(dǎo)的肺損傷轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并將全長人MDA5 c DNA生成并亞克隆到含有SP-C啟動子、SV40小T內(nèi)含子和polyA信號的3.7SPC/SV40載體的Sal I位點(diǎn)，并被指定為SPC-MDA5，將Nde I和Not I消化的線性DNA片段注射到BDF1小鼠受精卵中，使用此轉(zhuǎn)基因小鼠與B6小鼠交配產(chǎn)生半合子Tg小鼠，培育出了人MDA5轉(zhuǎn)基因小鼠；研究者還用芽孢病毒Ac NPV和p PSC8/人類MDA5共感染的SF9細(xì)胞中分離出重組人MDA5蛋白。用重組人MDA5蛋白免疫特異性無病原體兔，使用蛋白G柱從免疫兔血清中純化得到抗人MDA5抗體。
用抗MDA5多克隆抗體每周免疫1次，共4周，在第28天和第56天剖殺小鼠進(jìn)行組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)小鼠于28 d剖殺時即出現(xiàn)ILD癥狀，56 d時ILD持續(xù)加重，但I(xiàn)LD的發(fā)病時間和持續(xù)時間未知；用抗MDA5多克隆抗體免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠肺泡間隔出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡塌陷；免疫組化顯示人MDA5蛋白在免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的肺泡上皮和肺泡巨噬細(xì)胞出現(xiàn)表達(dá)，同時Ig G、Ig M、Ig A和補(bǔ)體C3在免疫小鼠的肺部均強(qiáng)烈表達(dá)，而Ig G、Ig M、Ig A和補(bǔ)體C3在肺泡上皮中強(qiáng)烈表達(dá)與臨床較為吻合。此模型的出現(xiàn)也為進(jìn)一步揭示抗MDA5自身抗體在IIM-ILD患者疾病進(jìn)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。
小結(jié)
目前尚無單一的動物模型能完全再現(xiàn)IIM-ILD的臨床和病理特征，特別是各種模型ILD的發(fā)病時間、持續(xù)時間或能否自然消退等并沒有詳細(xì)的研究。但在過去幾年中IIM-ILD仍取得了很大的進(jìn)展，特別是針對抗合成氨酶抗體相關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)的開發(fā)。希望未來構(gòu)建出相對簡易、經(jīng)濟(jì)、全面反映人IIM-ILD特征的動物模型，也希望正在開發(fā)的動物模型能繼續(xù)闡明IIM-ILD不同亞群的免疫發(fā)病機(jī)制，為新治療靶點(diǎn)的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
Source: 天津醫(yī)藥. 2024，52 （07），特發(fā)性炎性肌病相關(guān)間質(zhì)性肺疾病動物模型概述
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